Взгляд на историю через призму генетических исследований

Исполнилось 17 лет с тех пор, как было официально вскрыто групповое захоронение на Старой Коптяковской дороге под Екатеринбургом, ранее обнаруженное группой А.Н.Авдонина. Изначально происхождение захоронения связывалось с семьей последнего русского императора, расстрелянной в подвале дома инженера Ипатьева в ночь с 16 на 17 июля 1918 года, а последующие усилия были направлены на поиск соответствующих доказательств.

Первый этап исследований включал краниофациальную идентификацию, медико-антропологическую, судебно-стоматологическую экспертизы и судебно-медицинскую оценку повреждений костей. Кроме этого этап включал генетическую экспертизу в Алдермастонском Криминалистическом центре МВД Великобритании, завершенную в 1993 году. Генетическое исследование включало анализ присутствия в образцах ДНК Х и Y хромосом — для идентификации половой принадлежности и STR-маркеров — с целью выявления семейной группы. Полученные результаты позволили с уверенностью ответить на поставленные вопросы, вместе с тем основной вопрос о принадлежности останков императорской семье остался открытым. В настоящее время анализ полиморфизма STR-маркеров ядерной ДНК считается золотым стандартом для идентификации личности. Однако в то время для проведения идентификационной экспертизы в качестве объекта была избрана последовательность D-петли митохондриальной ДНК (мтДНК), экстрагированной из костных останков. Одновременно была предпринята попытка воссоздания Гессенской родословной линии, к которой относится Николай Романов (Рис. 1). Для этого была изучена последовательность фрагментов мтДНК образцов крови прямых потомков ветви — герцога Джеймса Георга Александра Карнеги, пожелавшего сохранить инкогнито под псевдонимом «герцог Файф» (пра-правнук Луизы Гессен-Кассель, дистанция 4 поколения), и графини Ксении Шереметевой Сфири (пра-пра-правнучка Луизы Гессен-Кассель, дистанция 5 поколений) в сравнении с последовательностью мтДНК фрагментов скелета N4, предположительно Николая Романова (внук Луизы Гессен-Кассель, дистанция 2 поколения).

С целью идентификации женских останков, найденных в захоронении, исследовалась мтДНК образца крови мужа здравствующей королевы Великобритании Елизаветы II принца-консорта Филиппа герцога Эдинбургского (внучатый племянник супруги Николая II Романова императрицы Александры Федоровны и пра-правнук императора Николая I Романова). Так как для идентификации останков использовалась мтДНК, наследуемая исключительно по материнской линии, в исследовании мтДНК Елизаветы II не было необходимости несмотря на то, что она является прямой наследницей Романовых по мужской линии (внучатая племянница императора Николая II и пра-правнучка Луизы Гессен-Кассель). *

Итогом исследования, имеющим важнейшее значение для дальнейшей идентификации останков Николая Романова, было выявление несовпадения последовательности нуклеотидов цепи мтДНК в положении 16.169 между ныне живущими потомками и фрагментом скелета N4. Одновременно в мтДНК скелета N4 была выявлена, как тогда считали, редчайшая «гетероплазмия» — присутствие у одного объекта как мутантного генома (мутантный нуклеотид ти-мин — Т в положении 16.169), так и генома «дикого» или естественного типа, присущего остальному населению (цитозин — С). Заключение об уникальности гетероплазмии было сделано на основании сравнения с данными о 4.950 разновидностях участка D-петли мтДНК, имевшихся на тот период в базе данных центра.

Вместе с тем, факт мутационного изменения мтДНК в Гессенской родословной линии к концу I этапа экспертизы окончательно не был установлен, а вероятность принадлежности костного образца скелета N4 Николаю Романову, по мнению экспертов, составила 70:1 (неопределенная модель). Поэтому, с точки зрения современной криминалистики «…результат нельзя было считать достаточно доказательным для такого экстраординарного случая» [1].

Следует отметить, что неопределенность идентификации явилась следствием впервые зарегистрированного феномена гетероплазмии и невозможностью апеллировать к другим базам данных, содержащих сведения о распространенности выявленной мутации.

Для подтверждения мутационной природы гетероплазмии, в 1995 г. исследования были продолжены в Военно-медицинском институте Министерства обороны США. Проводился сравнительный анализ образцов мтДНК из фрагментов скелета N4 и мтДНК из костной ткани младшего брата Николая Романова — Георгия, умершего в 1898 году и похороненного в Петропавловском соборе Санкт-Петербурга (Рис. 1). К сожалению, в США не исследовались остальные объекты, ранее изучавшиеся в Великобритании.

В процессе анализа мтДНК Георгия Романова присутствие гетероплазмии в положении 16.169 было подтверждено с несколько иным соотношением, чем у фрагмента скелета N 4 (у Георгия отношение цитозин/тимин (С/Т) — 40/60; у скелета N4 С/Т — 70/30).

На основании II этапа исследований был сделан вывод о том, что в Гессенской ветви Романовых произошла мутация мтДНК, проявившаяся у обследованных объектов в виде гетероплазмии. Последняя явилась результатом дифференциальной сегрегации общего пула материнской мтДНК, который, предположительно, также был гетероплазмичным. В свете этих данных гомоплазмичное состояние мутации у обследованных представителей потомков Луизы Гессен-Кассель четвертого и пятого поколений, по мнению исследователей, должно свидетельствовать о фиксации мутации, указывающей на мутационную природу выявленных различий. Полученные результаты позволили перейти к определенно-мутационной модели с вероятностью позитивности идентификации скелета N4 как принадлежащего Николаю Романову 1:84 800.

На сделанное заключение никак не повлиял ряд несоответствий, в частности крайне высокие темпы (в 2 раза за три года) сегрегации мутантной мтДНК у императрицы Марии Федоровны — матери Николая (родился в 1868 г., доля мутантного тимина 30%) и Георгия (родился в 1871 г., доля мутантного тимина 60%) Романовых, а также результаты тестирования образца крови родного племянника Николая II — Т.Н.Куликовского-Романова (сын сестры Николая и Георгия Романовых — Ольги; Рис. 1), выполненные в 1995—1997 гг. в Канаде и Японии (Е.И.Рогаев, Татсуо Нагаи) и не совпавшие с ранее выявленной особенностью мтДНК потомков Луизы Гессен-Кассель (у Т.Н.Куликовского-Романова в положении 16.169 определена гомоплазмия С, характерная для большинства населения). Японские исследователи так же не подтвердили присутствие гетероплазмии 16 169 С/Т в мтДНК Георгия Романова.

Определяющим звеном всей идентификации мог стать ДНК-анализ пятен крови Николая II с платка и подушки, которые после покушения на него в 1891 г. сохраняются в музее г. Отцу (Япония), а так же изучение мтДНК императрицы Марии Федоровны (до принятия православия — датская принцесса Дагмара, дочь Луизы Гессен-Кассель, дистанция 1 поколение; Рис. 1), останки которой с 1928 г. находились в королевской усыпальнице в Дании (согласно завещания ее останки доставлены в Россию и перезахоронены рядом с гробом супруга — императора Александра III Романова в Петропавловском соборе Санкт-Петербурга. На данном этапе исследование ее мтДНК может иметь решающее значение).

Интерес представляло сравнительное исследование мтДНК родной сестры супруги Николая II императрицы Александры Федоровны — Елизаветы Федоровны (ее останки были вывезены из Алапаевска и через Шанхай доставлены в Иерусалим, где сохраняются с 1920 г.).** Историческое значение мог представить и сравнительный анализ мтДНК останков лейб-медика Е.С.Боткина, расстрелянного вместе с царской семьей, и его отца — знаменитого русского терапевта С.П.Боткина.

Однако на тот момент результаты исследований были признаны достаточными, а их продолжение нецелесообразным, тем более, что приближались «круглые» даты — связываемый с именем Б.Н. Ельцина снос дома Ипатьева (1977 г.) и, наконец, июль 1998 года. Поэтому дополнительные исследования, а значит сомнения в уже сделанных выводах, могли помешать процедуре публичного покаяния.

Между тем сомнения остались, чему способствуют воспоминания участников тех событий, в частности Анатолия Ивановича Парамонова, демонстрировавшего захоронение гостям города, в том числе поэту В.В.Маяковскому (в 1928 г.).

Член городского совета, а затем его председатель в личной беседе с автором рассказывал, что в одно время с царской семьей была расстреляна еще одна — местного купца, обвиненного в противодействии властям, но о ней вспомнили только после первичного захоронения останков царской семьи в шахте. Заметив свидетеля этого события, исполнители решили перезахоронить в шахте останки купеческой семьи, а царской — сжечь. Однако ввиду высокой влажности дрова не горели, а керосина хватило для уничтожения только двоих (Алексея и его сестры). Поэтому части трупов из одной семьи были перезахоронены с другими с целью помешать поискам, тем более, что передовые отряды Колчака были уже на подступах к городу. В связи с этим из могилы на Старой Коптяковской дороге не делали секрета — потому, что… «ни-колашки там и не бывало».

Другое захоронение (ия), скорее всего, было произведено поблизости, но попытки его найти в тот период (группой А.Н.Авдонина) остались безуспешными, несмотря на насыщенность территории костными фрагментами (местность использовалась для тайного захоронения жертв революционного террора в первый год Советской власти. Отсюда, по-видимому, уверенность П.Л.Войкова (организатора ликвидации трупов) в том, что «мир об этом никогда не узнает»).

Принимая во внимание возможное присутствие в захоронении местных геномов, важным фактором, способным внести дополнительную неопределенность, является генетический полиморфизм генофонда жителей Уральского региона.

В последние годы получены данные исследования мтДНК жителей соседних регионов, которые подтверждают, что к западу и востоку от Урала обитают разные расы — европеоиды и монголоиды, а генофонд местного населения вобрал в себя все разнообразие известных в мире геномов.

Формирование уникального генофонда с исторической точки зрения происходило в три этапа:

1. Первичная миграция людей 60−70 тыс. лет назад — перенос через Урал монголоидных и европеоидных геномов (Рис. 2).

2. Великое переселение кочевых народов из Сибирских «ядер» расообразования менее 10 тыс. лет назад — обратный перенос геномов, сформировавших современное население Европы. Войны, уничтожившие целые народы, и связанные с изменчивым плодородием южно-уральских степей большие и малые миграции, оставили на Урале свой след. Спасительная миграция кочевых племен была направлена не только на запад, но и на север, где в суровых климатических условиях Уральских гор до сих пор сохранился уникальный генофонд.

3. Современные миграции и переселения, связанные с открытием и освоением новых земель — последние 500 лет.

Вероятно поэтому у 17% этнических русских — коренных уральцев встречаются уникальные ДНК-мутации, имеющиеся в мире только у бурят, татар, мордвы, якутов (до 80%) и более чем у 20% современных финнов (замена Т на С и сходные микросателлитные наборы в У-хромосоме). В свою очередь, у уральских монголоидов присутствуют маркеры, характерные для типичных современных европеоидов (например, в положении 10.394, но не 10.397 мтДНК).

В связи с возможным присутствием в костных останках следов уральских геномов и сомнениями в результатах генетических тестов, высказанных в личной беседе Александром Николаевичем Авдониным, был предпринят анализ основных доказательных элементов:

— исследование возможности присутствия мутации в положении 16.169 мтДНК в геномах лиц, не имеющих очевидных родственных связей с потомками Луизы Гессен-Кассель;

— с позиции современных данных оценить частоту встречаемости гетероплазмии среди известных мутаций мтДНК.

Признание мутантного происхождения мутации мтДНК в положении 16 169 обусловил поиск подобной мутации у контингента жителей территории Восточно-Уральского радиационного следа Свердловской области, первое поколение которых проживало в зоне максимального загрязнения. Именно у этой группы зафиксированы наибольшие темпы накопления мутаций в митохондриальном геноме [2].

В лаборатории молекулярных медицинских технологий УГМА в течение ряда лет проводится отбор и исследование ДНК жителей Уральского региона, часть которой пополняет вну-трилабораторный банк ДНК. Исследовалась нуклеотидная последовательность фрагмента D-петли мтДНК 120 человек — современных жителей Каменского района Свердловской области. Выполнение задачи было значительно облегчено целевым поиском мутации в положении 16.169 из более чем тысячи нуклеотидных пар D-петли мтДНК.

Для решения задачи применяли секвенирование с использованием меченых дидезокси-нуклеозидтрифосфатов (Amersham) по методу Ф. Сэнгера [17], блокирующих 3'-конец — ди-дезоксиаденозина (для выявления комплементарного тимина) и дидезоксигуанозина (для выявления цитозина) в избранном коротком участке D-петли мтДНК, располагающегося рядом с участком связывания праймера.

Оказалось, что у одной жительницы Каменского района, чьи родители были отселены после аварии 1957 года на ПО «Маяк» вследствие высокого радиационного загрязнения, в положении 16.169 выявлена транцизия нуклеотида, качественно совпадающая с классической Гессенской мутацией. Интересно, что аналогичная мутация определена и у ее сына. Это подтверждает «неслучайность» данного отклонения, переданного ребенку от матери.

Последовательности участков D-петли мтДНК из фрагментов костей скелетов N 4 и Георгия Романова, крови Ксении Шереметевой-Сфири [1] и последовательности D-петли матери и сына Н., представлены на рисунке 3 (стрелкой отмечено положение 16.169).

К сожалению, использованная методика не позволила дифференцировать данную мутацию по признаку плазмии. Так же не дифференцировалась возможная принадлежность семьи Н. к Гессенской ветви, хотя уже само предположение о проживании потомков этой ветви по материнской линии в одной из деревень Свердловской области вряд ли заслуживает серьезного исследования.

По-видимому, появление подобной мутации могло быть обусловлено либо краевым характером данной мутации (распространенностью в местной популяции), либо высоким мутагенным фоном территории (не только техногенного, но и природного происхождения).

В том случае, если допустить возможность присутствия в захоронении местных геномов, а так же если дальнейшие исследования подтвердят распространенность данной мутации в генофонде уральских жителей, тогда вероятность позитивности идентификации скелета N4 как останков Николая Романова резко снизится.

Ключевым положением официальной экспертизы скелета N4, позволившим сменить неопределенную модель на определенную, стала впервые выявленная гетероплазмия.

Следует отметить, что 15 лет, прошедших с первого выявления гетероплазмии, характеризовались накоплением сведений о вариантах, качественных и количественных параметрах мутаций мтДНК. В настоящее время многие данные свидетельствуют о чрезвычайно высокой распространенности этого явления [3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Так, среди 159 зарегистрированных фенотипически значимых разновидностей мутаций мтДНК 116 или 73% являются гетероплазмичными. При этом 98 или 61.6% являются абсолютно гетероплазмичными, а у носителей 18 (11.3%) мутаций у одних индивидов присутствует гетеро- у других — гомоплазмия. И лишь для 43 мутаций (27.0%) подтверждена гомоплазмия. Распространенность гетероплазмии среди мутаций мтДНК обусловлена состоянием частичной фиксации, то есть существованием короткоживущего (2−5 поколений) переходного состояния, обычно завершающегося формированием мутантного гена или возвратом к гену «дикого» типа.

Итогом выполненных исследований и современных данных о распространенности гетероплазмии может стать возврат к неопределенной модели в качестве основной. При этом вероятность доказательности идентификации останков последнего русского императора может составить менее 70:1, что вряд ли приемлемо для данного случая.

В июле 2008 года исполняется 90 лет, прошедших с той трагедии. На месте дома Ипатьева построен «Храм на крови», величественность которого отражает ту единственную определенность, имеющуюся пока в этом вопросе.

СНОСКИ:
* После смерти Королевы-Матери Елизаветы I (30.03.02) королева Великобритании Елизавета II Виндзорская по праву первой крови стала первой прямой наследницей всех активов семьи Романовых, хранящихся в зарубежных банках (оценочно более 30 млрд долл. США). Столь значительная сумма будет выплачена королевской семье по истечении трех лет после получения справок о смерти семьи Романовых.
Оригиналами таких документов, составленных на основании заключения Правительственной комиссии, располагает княгиня Леонида Романова и ее внук — самопровозглашенный наследник Российского престола Георгий Романов-Гогенцоллерн, проживающие в Париже. Этот искусственно созданный прецедент придает последним известный вес в отстаивании своих сомнительных прав на престолонаследие. Поэтому интрига вокруг останков, найденных под Екатеринбургом, к настоящему времени приобрела не только исторический, но и обостренные политический и меркантильный контексты (по крайней мере, для сторонников позитивности идентификации Романовых).

** Исследование мтДНК Елизаветы Федоровны было выполнено в США в двух независимых лабораториях (Станфордский университет и Лос-Аламос) в 2003 г. проф. Л.А. Животовским. Результаты выявили расхождение с ранее опубликованной последовательностью мтДНК Александры Федоровны сразу по многим позициям (16.111 Т (С); 16.129 G (А); 16.327 С (Т)), что ставит под сомнение принадлежность образцов близким родственникам [7].

ЛИТЕРАТУРА:
1. Иванов П.Л., Ж-л.: Судебно-медицинская экспертиза, N4, 1998, С. 30−47.
2. Макеев О.Г., Ястребов А.П., Измайлов И.Х., Костюкова СВ., Леонтьев И.Л., Тарасе-вич А.А., Воробьев А.В. Влияние факторов окружающей среды на процессы мутагенеза и состояние здоровья жителей г. Каменск-Уральский. Вестник Уральской медицинской академической науки, г. Екатеринбург, 2003, N 1, С. 27−33.
3. Boore J.L. Transmission of mitochondrial DNA-playing favorites? Bioessays 1997 Sep; 19(9):751−3.
4. Chinnery P.F., Samuels D.C. Relaxed replication of mtDNA: A model with implications for the expression of disease. Am J. Hum. Genet. 1999 Apr; 64(4):1158−65.
5. Cortopassi G., Wang E. Modelling the effects of age-related mtDNA mutation accumulation; complex I deficiency, superoxide and cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1995 May;
6. Druzhyna N., Nair R.G., LeDoux S.P., Wilson G.L. «Defective repair of oxidative damage in mitochondrial DNA in Down’s syndrome». Mutat. Res. 1998 Nov; 409(2):81−9.
7. Knight A., Zhivotovsky L.A., Kass D.H., Litwin D.E., Green L.D. Molecular, forensic and haplotypic inconsistencies regarding the identity of the Ekaterinburg remains. Annals of Human Biology, 2004, 1−8.
8. Lenaz G. Role of mitochondria in oxidative stress and ageing. Biochim. Biophys. Acta. 1998Aug;1366(l-2):53−67.
9. Letellier Т., Malgat M., Rossignol R., Mazat J.P. Metabolic control analysis and mitochondrial pathologies. Mol. Cell Biochem 1998 Jul; 184(l-2):409−17.
10. Lu C.Y., Lee H.C., Fahn H.J., Wei Y.H. Oxidative damage elicited by imbalance of free radical scavenging enzymes is associated with large-scale mtDNA deletions in aging human skin. Mutat. Res. 1999 Jan; 423(1−2):11−21.
11. Michikawa Y., Mazzucchelli F., Bresolin N., Scarlato G., Attardi G. Aging-dependent large accumulation of point mutations in the human mtDNA control region for replication [see comments]. Science 1999 Oct; 286(5440):774−9.
12. Miquel J. An update on the oxygen stress-mitochondrial mutation theory of aging: genetic and evolutionary implications. Exp. Gerontol. 1998 Jan; 33(l-2):113−26.
13. Ozawa T. Mechanism of somatic mitochondrial DNA mutations associated with age and diseases. Biochim. Biophys. Acta. 1995 May; 1271(l):177−89.
14. Ozawa T. Mitochondrial genome mutation in cell death and aging. J. Bioenerg. Biomembr. 1999 Aug; 31(4):377−90.
15. Robinson B.H. MtDNA and nuclear mutations affecting oxidative phosphorylation: correlating severity of clinical defect with extent of bioenergetic compromise. J. Bioenerg. Biomembr. 1994 Jun; 26(3):311−6.
16. Rothman S.M. Mutations of the mitochondrial genome: clinical overview and possible pathophysiology of cell damage. Biochem. Soc. Symp. 1999; 66:111−22.
17. Sanger E, Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. 1977; 74:5463−5467.